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Aug 09, 2023

PCR アッセイ設計における課題と解決策

クレジット: Sebastian Condrea / Getty Images 再現可能な PCR アッセイの設計には、場合によっては微量の反応量で各成分を標準化することから、複数の移動ターゲットを最適化することが含まれます。

クレジット: セバスチャン・コンドレア/ゲッティイメージズ

再現性のある PCR アッセイの設計には、場合によっては微量の反応量での各成分の標準化から、試薬、サンプル、PCR 製品の長期安全な保管を確保するための事前の計画まで、複数の移動ターゲットの最適化が含まれます。

PCR ベースの診断検査の開発と最適化に伴う複雑さと共通の課題を理解することは、研究者が利用可能な最新のソリューションを使用してそのような障害を克服するのに役立ちます。 ここでは、PCR ベースの分子診断アッセイを設計する際に研究者が遭遇する可能性のある一般的な課題のいくつかと、考えられる解決策について説明します。

PCR 反応を設計する際に最初に直面する課題の 1 つは、アプリケーションに最適なポリメラーゼを選択することです。 生体サンプルの特性、増幅する配列の長さ、増幅産物の望ましい配列精度を考慮してニーズを比較検討することが重要です。

PCR アッセイの最適化に豊富な経験を持つ Fortis Life Sciences のフィールド アプリケーション サイエンティストである Gerald Hunter 博士は、「DNA ポリメラーゼが異なれば、特異性、酵素機能、エラー率 (忠実度)、PCR 阻害剤に対する耐性も異なります。」と述べています。

意図した温度で高い特異性で DNA テンプレートにアニールするプライマーを設計し、反応混合物の組成を最適化することは、次の課題となります。

「PCR の成功は、反応が非特異的プライマー結合の比率を低く維持できるかどうかに基づいています。したがって、アニーリング温度は最適化する必要がある重要な要素になります」とハンター氏は言います。 「さらに、PCR バッファーの成分 (pH、塩、Mg2+、プライマー、酵素濃度など) はすべて反応のパフォーマンスに影響を与えるため、考慮する必要があり、場合によっては最適化が必要になる場合があります。」

非特異的増幅は一般に、プライマーが設計されていない配列に結合する場合に発生します。 その結果、意図しない製品が生成されます。

「プライマーのデザインは芸術であると同時に科学でもあります。 適切なプライマー濃度だけでなく、適切なプライマー配列を持つことも重要です」とハンター氏は言います。 「幸いなことに、PCR プライマー設計に使用できる無料のオンライン プライマー設計ソフトウェア ツールが多数ありますが、適切な組み合わせを見つける前に、いくつかのプライマー ペア セットをテストする必要があることに気付いても、驚かないでください。」

非特異的増幅を回避する 1 つの方法は、PCR チューブまたはストリップをサーマルサイクラーに挿入する準備ができるまで、反応ミックスを氷上で準備することです。 低温により DNA ポリメラーゼの活性が低下し、プライマーが不正確に結合する可能性が減少します。 この予防策にもかかわらず、望ましくない生成物が合成される可能性があります。

非特異的増幅に対抗するための追加の解決策は、ホットスタート DNA ポリメラーゼを使用することです。 ホットスタート DNA ポリメラーゼは、室温では不活性になるように化学的に修飾されており、非特異的な増幅を防ぎます。 ヌクレオチドは、熱活性化ステップが発生すると、修飾酵素によってのみ結合されます。 これにより、偽の産物やプライマーダイマーの形成の可能性なしに、室温での PCR 反応の組み立てが可能になります。 ホットスタート PCR のさらなる利点は、熱活性化を行わない反応サイクル条件をネガティブコントロールとして使用できることです。

多重化とは、パラメーターごとに個別のテストを実行するのではなく、単一のテストでさまざまな状態や要因を検出できる機能です。1 これにより、スループットが向上し、テストのコストが削減され、患者ケアの効率が向上します。

多重化はプライマー設計によって課題となることがよくあります。 マルチプレックス PCR 用のプライマーは、均一な長さのアンプリコンを生成する一貫した融解温度でターゲット シークエンシングに対して高度に選択的である必要があります。 これには、プライマーを設計する際に慎重な計算が必要です。 設計が不適切な場合、プライマーはホモまたはヘテロ二量体を形成したり、オフターゲット配列を増幅したりすることがあります。