Jun 13, 2023
ヒトサイトメガロウイルスサブウイルス高密度体とのインキュベーションによる線維芽細胞および内皮細胞のプロテオーム変化
Scientific Data volume 10、記事番号: 517 (2023) この記事を引用 255 アクセス 32 Altmetric メトリクスの詳細 ヒト サイトメガロ ウイルス (HCMV) は、医学的に関連性の高い病原体です。 サブウイルス濃厚
Scientific Data volume 10、記事番号: 517 (2023) この記事を引用
255 アクセス
32 オルトメトリック
メトリクスの詳細
ヒトサイトメガロウイルス (HCMV) は、医学的に関連性の高い病原体です。 サブウイルス密集体 (DB) は、HCMV 感染の深刻な結果を改善するワクチン候補として開発されました。 このようなヒトへの適用のための候補ワクチンの開発には、宿主との相互作用に関する詳細な知識が必要です。 DB に曝露された細胞培養細胞のプロテオームの変化に関して、包括的な質量分析 (MS) ベースの分析が実行されました。
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）はβヘルペスウイルスであり、世界中で先天性感染症の主な原因となっており、難聴、視覚障害、認知障害などの多くの後遺症を引き起こします1。 全身性免疫抑制の状況では、HCMV 感染はかなりの罹患率と死亡率を引き起こす可能性があります 1。 HCMV に感染した線維芽細胞は、高密度体と呼ばれる非感染性粒子を細胞培養上清中に大量に放出します 2,3。 単離された DB の質量分析は、そのタンパク質組成の解明に貢献し、HCMV4,5 に対する適応免疫応答の重要な抗原の存在を明らかにしました。 一方、インビトロ実験と動物研究では、DB が顕著に免疫原性があり、強力なインターフェロン (IFN) 応答を誘導することが示されました 6、7、8、9、10、11。 その結果、DB は HCMV に対する有望なワクチンとして考えられています12,13。 臨床試験および最終的な認可における候補ワクチンのヒトへの適用に関しては、潜在的な副作用と忍容性を評価するために、宿主細胞に対するワクチンの影響に関する包括的な知識が重要です。 培養線維芽細胞および内皮細胞に対する DB の影響に関するデータセットは、質量分析 (MS) を使用して生成されました。 これらのデータセットは、DB 曝露時のインターフェロン β 応答と線維芽細胞および内皮細胞におけるインターフェロン刺激遺伝子 (ISG) 発現の誘導の研究に焦点を当てた以前の出版物で使用されました 11。
初代ヒト包皮線維芽細胞 (HFF) は 1994 年に新生児の包皮から確立され、過去に研究に使用されました 6、7、14、15、16。 これらの細胞を研究に使用する承認は、ドイツのラインラント・プファルツ州医療評議会の倫理委員会から得られました。 HFF は、5% ウシ胎児血清 (FCS)、100 mg/l L-グルタミン、0.5 ng/ml 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF、Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ）およびゲンタマイシン（5 mg/l）。 実験には、16 ～ 19 の HFF 細胞継代数を使用しました。 HEC-LTT 細胞は Dagmar Wirth らによって樹立されました17。 この細胞は、SV40ラージT抗原およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)のテトラサイクリン依存性発現により条件的に不死化されたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に由来する。 培養のために、培養容器を０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）で少なくとも３０分間コーティングした。 HEC-LTT細胞は、2μg/mLのドキシサイクリン（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を補充した内皮増殖培地（EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd.、バーゼル、スイス）中で維持した。 HEC-LTT 細胞の増殖はドキシサイクリン (DOX) によって制御できます。 DOX を添加すると、不死化タンパク質 hTERT および SV40 ラージ T 抗原の発現が活性化され、細胞増殖が起こります。 ドキシサイクリンは実験全体を通じて省略されました。 HEC-LTT 細胞を研究目的で使用する許可は、ヘルムホルツ感染症研究センター (HZI) による物質譲渡契約を通じて付与されました。 細胞は HCMV 感染に対して寛容であることが示されました 18。 HEC-LTT は、Christian Sinzger (ドイツ、ウルムのウルム大学医療センターウイルス学研究所) のご好意で私たちに送っていただき、継代 41 から継代 55 までの実験に使用されました。
1.0-fold with p-value < 0.05 (green dots), and 35 proteins that were decreased by < − 1.0-fold with p-value < 0.05, (red dots). The HCMV tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and its detection was used as a positive control, indicating DB internalisation into HFF. The volcano plot was generated using the R software. (b + c) Protein-Protein Interaction (PPI) analysis and functional classification of the regulated proteins in HFF after DB-stimulation. (b) Display of the STRING PPI network generated upon entering the 68 regulated proteins into the STRING database. The network nodes represent all the proteins produced by a single protein-coding gene locus. Nodes are coloured according to their function in the indicated biological processes in c. Grey nodes indicate proteins connected to the input proteins but without association with the biological processes. Connections reflect protein interaction and the line thickness indicates strength of the data support, using a high confidence cut-off with a score of 0.7. Proteins with no interaction to other proteins in the network were removed. (c) Bar chart of the biological processes, connected to the proteins that were found to be regulated in HFF after DB-stimulation. The arrangement was performed according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) Heatmap of the 45 altered ISGs. The expression patterns were arranged hierarchically based on the mean of the log2 converted normalized ratio from 5 biological replicates. The log2FC is represented with a colour gradient. IFN, Interferon; ISG, Interferon-stimulated gene; STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p> 1.0; p < 0.05). Blue dots indicate differentially expressed proteins that were significantly upregulated (fold change < 1.0; p < 0.05). The viral tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and was used as a control for DB internalisation into ECs. The volcano plot was generated using the R software. (b) STRING Protein-Protein Interaction network of the 83 proteins that were differentially expressed in ECs upon DB treatment. Proteins with no associations to other proteins in the network were removed. Network nodes represent all the proteins produced by a single, protein-coding gene locus. Lines depict protein interaction and the line thickness indicates the strength of the data support with a minimum confidence cut-off of 0.7 (high confidence). (c) Bar chart of the enriched biological processes associated with differentially expressed proteins. The top ten enriched biological processes are arranged according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) 60 differentially regulated proteins were designated as IRGs. The log2FC is represented with a colour gradient. The 20 up-regulated ISGs are indicated in blue and the 40 down-regulated ISGs are indicated in red. STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p>
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